2. Diluya el tampón de lavado a razón de 1:40 con agua destilada antes de usarlo.
3. Agregue 100 μL de diluyente de muestra en el pocillo correspondiente (no agregue en el pocillo en blanco, negativo
pocillos de control y pocillos de control positivo). La muestra debe corresponder al número de micro
placa, cada placa debe contar con 2 pocillos de control negativo, 1 pocillo de control positivo y blanco
controlar 1 pozo. Agregue 5μL de muestra en el pocillo correspondiente, mezcle bien usando la pipeta, agregue
50 μl de control negativo y control positivo a los pocillos de control negativo y al pocillo de control positivo (no
agregue el pocillo en blanco).
Nota: Utilice una punta de pipeta de desecho separada para cada muestra, control negativo y positivo para
evitar la contaminación cruzada.
4. Agite suavemente para mezclar durante 30 segundos. Incubar a 37°C durante 20 minutos con la membrana de la placa de sellado.
sellando la placa.
5. Al final de la incubación, retire y deseche la cubierta de la placa. Sacar, agregar tampón de lavado a
cada pocillo durante 20 segundos. Repita 5 veces. Después del ciclo de lavado final, gire la placa sobre
papel secante o toalla limpia y golpéelo para eliminar los restos.
6. Agregar respectivamente 50 µL de conjugado enzimático (no agregar en el pocillo en blanco)
7. Incubar a 37°C durante 20 minutos con la membrana de la placa selladora sellando la placa. Repita el
Lave el paso 5 veces como en el paso 5.
8. Agregue 50 µL de Sustrato A y 50 µL de Sustrato B (No agregue en el pocillo en blanco). Incubar a 37 ℃ durante
10 minutos con la membrana de la placa selladora sellando la placa.
9. Agregue 50 μl de solución de parada a cada pocillo (no agregue en el pocillo en blanco). Mezclar suavemente agitando, leer las
absorbancia dentro de los 10 minutos posteriores a la interrupción de la reacción. Calibrar el lector de placas con el Blanco
bien y lea la absorbancia a 450 nm. Si se utiliza un instrumento de filtro dual, establezca la referencia
longitud de onda a 630 nm. No se permite configurar ningún pozo en blanco si se utiliza una longitud de onda dual para detectar. Calcular el
Valor de corte y evaluar los resultados.
Cronometría: lea la densidad óptica (OD) de la muestra a 450 nm con un lector de microplacas.
El valor medio de DO del control negativo ≤ 0,1 y el valor medio de DO del control positivo ≥ 0,8, la prueba es válida.
de lo contrario la prueba no es válida.
Valor de corte (CO) = Valor medio de DO del control negativo x 3 (calculado en 0,10 cuando el valor medio
El valor OD del control negativo es < 0,10, calculado por el valor real cuando la OD media del control negativo
el valor es > 0,10)
Resultados positivos: valor de DO de la muestra ≥ CO
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